课程：

• 1、如何用ImageJ做双标或多标荧光共定位分析
• 2、免疫荧光双标
• 3、如何做原位杂交和免疫荧光双标
• 4、免疫荧光共标记怎么计算共标记的细胞个数
• 5、如何证实细胞膜上两个蛋白的位置关系

如何用ImageJ做双标或多标荧光共定位分析

曲轴位置传感器的作用就是确定曲轴的位置，也就是曲轴的转角。它通常要配合凸轮轴位置传感器一起来工作--确定基本点火时刻。我们都知道，发动机是在压缩冲程末开始点火的，那么发动机电脑是怎么知道哪缸该点火了呢?就是通过曲轴位置传感器和凸轮轴位置传感器的信号来计算的，通过曲轴位置传感器，可以知道哪缸活塞处于上止点，通过凸轮轴位置传感器，可以知道哪缸活塞是在压缩冲程中。这样，发动机电脑知道了该什么时候给哪缸点火了。

免疫荧光双标

一般来说，选择合适的二抗需要从下面几个方面考虑：

1.二抗应选用与使用的一抗相同的物种来源;

2.二抗需与一抗的类别或亚类相匹配。这通常是针对单克隆抗体而言。多克隆抗体主要是IgG类免疫球蛋白，因此相应的二抗就是抗IgG抗体;

3.一般来说，不同的种属来源与二抗的质量没有必然的联系，来源于山羊的二抗与来源于驴的二抗在一般的实验里没有太多的差别。然而在一些特殊的实验里， 如双标实验里，如果其中一个一抗是山羊来源的，一个是小鼠来源的，则相应的二抗分别要抗山羊和抗小鼠的二抗，这时候，二抗就不能选择山羊或者小鼠来源的。

如何做原位杂交和免疫荧光双标

呃，实验原理完全不同，但应用上有所交叉，都可以达到检测某段基因在样品中的表达的目的。

楼主你要想彻底理解这个问题，真的必须分别理解这两个不同技术的内涵。老实阅读相关知识吧。这两个东西很少被相提并论，也不是互相可以替代的，单纯谈区别没有意义。

原位杂交是在分子生物学领域应用极为广泛的实验技术之一，是在研究生物体发育过程中的一种极为重要的分子遗传学的研究方法。其英文名为in situ hybridization,其中in situ为拉丁文，原义是"in its natural position". 字面的意思理解就是说在其原来的天然的位置处杂交。原位杂交主要是基于以下这个主要原理：单链的DNA或者RNA只要他们的序列是互补的，即符合AT，CG的碱基配对原则，那么这样的两条核酸链之间（DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA）就可以形成一个稳定的杂交复合体。这一原理对于检测一个特异的mRNA在某一种生物体，或者某些组织切片、单个细胞里具体表达位置非常有用。该技术最早应用于60年代末期，由于核酸分子杂交的特异性高，并可精确定位，因此该技术已被广泛应用，例如与细胞内RNA进行杂交以观察该组织细胞中特定基因表达水平。原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其他成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内DNA或RNA研究更为方便；同时由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。

核酸原位杂交可根据其检测物而分为细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据其所用探针及所要检测核酸的不同又可分为DNA-DNA, RNA-DNA, RNA-RNA杂交。但不论哪种杂交都必须经过组织细胞的固定，预杂交，杂交，冲等一系列洗步骤及放射自显影或免疫酶法显色以显示杂交结果。

我们在这儿介绍的是整胚原位杂交，不同于一般的在载片上对细胞和组织切片进行探针杂交及检测的原位杂交，而是对完整的斑马鱼胚胎进行探针杂交及检测，从整体上把握探针的结合部位，然后对胚胎进行切片，以确定探针结合的具体位置。整胚原位杂交在斑马鱼分子生物学研究中是一种非常重要的实验方法，原位杂交的探针可以是同位素的探针，用放射自显影来检测；也可以是非同位素的探针，通过荧光或酶法予以检测。我们这儿所介绍的一种原位杂交的方法是通过后者，以地高辛标记探针，然后用酶联抗体的方法进行检测。

免疫荧光共标记怎么计算共标记的细胞个数

共定位的定义：共定位是对样品内两种荧光标记的信号共同分布的位置进行分析。 共定位就如字面意思上所说的，只能够表明蛋白A和B都在此细胞有表达，并且在同样的细胞内位置/细胞器。相关短语：共定位通道 PDM Channel 细胞共定位 Cellular co localization 细胞内共定位信息 cellular co-localization 共深度点定位 CDP positioning 共表达和同定位 Co-expressed And Co-localized 双语例句：而在哺乳动物中，黏着素与CTCF隔离子蛋白共定位，并以依赖于CTCF的方式调控转录。 Finally, in mammals, cohesin co localizes with the CTCF insulator protein and controls gene expression in a CTCFdependent manner. 然后后来发现非活性形式AKT主要存在于胞质溶胶中，因此AKT2似乎不大可能与APPL蛋白共定位于内涵体。 However, AKT in this form mainly exists in cytoplasm. Therefore, it is not as possible as beforethat AKT2 could locates in endosomes with APPL proteins 免疫荧光共定位染色法检测突变蛋白在内质网和高尔基体内分布。 Immunofluorescence co-localization analysis was used to examine the synthesis and secretion of the mutant protein.

如何证实细胞膜上两个蛋白的位置关系

证实两个蛋白在细胞膜上都有定位有许多种方法：

1，荧光报告基因：两个蛋白各自用荧光蛋白标记，比如GFP和RFP等，两者荧光光谱不可重叠，在共聚焦显微镜下在各自通道观察和merge后的图像分析，可见荧光重叠，即可证明共定位。

2，免疫荧光：要求两个蛋白都有抗体，或者带有不同的标签，如myc，flag等，然后用免疫组织化学的方法，做免疫荧光二抗双标，在共聚焦显微镜下，可以看到荧光共定位。

3，免疫电镜，同免疫荧光类似，二抗要用不同大小的胶体金标记的二抗，电镜下可以分辨是否共定位。

4，western：提取质膜后，用相应的抗体检测是否在质膜组分中可以同时检测到两种蛋白。