课程：

• 1、核定位的蛋白做免疫荧光需要dapi染色么
• 2、蛋白质的核定位序列
• 3、检验一种蛋白质在细胞中的定位实验方法及步骤 哪位博学的好心人帮忙解答一下，尽量详细，谢谢了。。。
• 4、核蛋白 怎么从胞质 定位到 胞核的
• 5、如何解释蛋白亚细胞定位在细胞核，但是蛋白跨膜预测为膜外蛋白

核定位的蛋白做免疫荧光需要dapi染色么

核定位的蛋白做免疫荧光需要dapi染色。

1．实验原理

免疫染色的实验原理类似于Western Blotting，两者都是运用抗体的特异性识别作用来显示目的蛋白，但是由于免疫染色需要在原位进行，而且蛋白没有经过富集，因此其实验难度较高。

实验的基本原理是：利用固定剂（通常是甲醛或多聚甲醛）将细胞固定，使得细胞膜的通透性大大增加，并且利用Triton-X-100使得一部分膜蛋白变性，从而使通透性进一步加强。利用正常羊血清封闭，可以令许多蛋白先与血清内的非特异性抗体结合，而特异性的抗体由于动力学的关系可以通过竞争性的反应与目的蛋白结合，这一过程可以保证抗体识别的特异性。

二抗可以特异性识别一抗的Fc区域，利用二抗连接不同的荧光基团，就可以在荧光显微镜下观察到不同的荧光，从而显示目的基因的表达情况。

另外，免疫荧光实验由于其较高的敏感性可以显示出基因表达的亚细胞情况(核内，核外，膜上以及一些较大的细胞器上)，所以通常被用来作为基因定位的方法。

DAPI的中文名称是4，6-联脒-2-苯基吲哚，是一种常用的荧光染料，其作用机理与溴化乙锭（EB）等染色剂的机理类似：它们与DNA双螺旋的凹槽部分可以发生相互作用，从而与DNA的双链紧密结合。结合后产生的荧光基团的吸收峰是358nm而散射峰是461nm，正好UV（紫外光）的激发波长是356nm，使得DAPI成为了一种常用的荧光检测信号。

Jagielski M. et. Al在1976年首次运用该技术检测细胞培养中的支原体感染。后来随着技术的进步，该技术被运用于各种微生物的检测、生长监测，胚胎发育过程的检测，细胞周期的检测和各种核定位的实验。

蛋白质的核定位序列

核质蛋白向细胞核的输入可描述如下：①蛋白与NLS受体，即imporin α/β二聚体结合；②货物与受体的复合物与NPC胞质环上的纤维结合；③纤维向核弯曲，转运器构象发生改变，形成亲水通道，货物通过；④货物受体复合体与Ran-GTP结合，复合体解散，释放出货物；⑤与Ran-GTP结合的imporin β，输出细胞核，在细胞质中Ran结合的GTP水解，Ran-GDP返回细胞核重新转换为Ran-GTP；⑥imporin α在核内exportin的帮助下运回细胞质

检验一种蛋白质在细胞中的定位实验方法及步骤 哪位博学的好心人帮忙解答一下，尽量详细，谢谢了。。。

步骤

蛋白质原位杂交

步骤

1、提取纯化该蛋白（提取及纯化蛋白质的方法生化上有讲到）

2、制取该蛋白的特异性抗体 （将提取的蛋白质注入小鼠体内，使它产生免疫反应，产生特异性抗体，然后提取小鼠血清，血清中含有相应抗体）

3、将抗体与荧光分子（如GFP),辣根过氧化物酶（HRP）等标记物连接

4、标记抗体与组织切片标本孵育，抗体与细胞中相应抗原发生特异性结合，结合部位被标记物显示

5、在显微镜下观察到该肽或蛋白质的分布（抗体分子如与荧光分子连接，就在荧光显微镜下观察；如与HRP连接，则在光镜和电镜下进行观察）

核蛋白 怎么从胞质 定位到 胞核的

核蛋白是指在细胞质内合成，

然后运输到核内起作用的一类蛋白质。如各种组蛋白、DNA合成酶类、RNA转录和加工的酶类、各种起调控作用的蛋白因子等。核蛋白一般都含有特殊的氨基酸信号序列，

起蛋白质定向、定位作用。

1.核定位序列（核定位信号，NLS）：亲核蛋白一般都含有特殊的氨基酸序列，这些内含的短肽保证了整个蛋白质能够通过核孔复合体转运到细胞核内，这段具有“定向”、“定位”作用的序列被称为核定位序列。

2.核输出信号（NES）：作为核内物质输出细胞核的信号，帮助核内某些分子迅速通过核孔进入细胞质，位于核内合成然后被运输到细胞质工作的分子中。

如何解释蛋白亚细胞定位在细胞核，但是蛋白跨膜预测为膜外蛋白

如何解释蛋白亚细胞定位在细胞核，但是蛋白跨膜预测为膜外蛋白

预测蛋白质的亚细胞定位，是通过生物信息学的方法的。

或者你在NCBI数据库中比对到了编码类似蛋白的基因，如果该基因有人做过亚细胞定位的实验，你也可以大概知道其编码的蛋白质在细胞内部的定位。不同物种，不同基因家族成员有可能有区别。最终还是需要实验来验证的。

功能基因研究中，经常会进行基因编码的蛋白质的亚细胞定位的，

如待定位蛋白和GFP、YFP、RFP等融合后，观察融合蛋白在细胞内的定位，

或者将预测部位（如该蛋白可能在液泡膜上）的蛋白提取出来，进行western实验，来验证等。