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双光子显微镜的概述与原理
双光子荧光显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术的一种新技术。双光子激发的基本原理是：在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收 2 个长波长的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子；其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。双光子激发需要很高的光子密度，为了不损伤细胞，双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲宽度只有 100 飞秒，而其周期可以达到 80 至 100 兆赫。在使用高数值孔径的物镜将脉冲激光的光子聚焦时，物镜的焦点处的光子密度是最高的，双光子激发只发生在物镜的焦点上，所以双光子显微镜不需要共聚焦针孔，提高了荧光检测效率。
如何利用激光共聚焦显微镜进行胞内蛋白定位
要用一个线粒体特异性的探针或者线粒体特异性定位的蛋白做免疫荧光以标记线粒体的位置,再以一种不同颜色的二抗标记目的蛋白,最后观察两种荧光的叠加情况.如果需要更精确的可以分离线粒体后用western blot检测.如果想用形态学方法建议共聚焦或者免疫电镜,选一种吧,但是看过很多线粒体的文章,用共聚焦的更多,不过需要根据的实际情况吧,免疫电镜也是认可的.
Ca2+作为细胞内的第二信使,调控着许多重要的生理活动.从六十年代开始,一些研究小组就已经开始合成各种荧光剂进行定量检测Ca2+浓度,目前常用的荧光剂有第二代的fura-2,indo-1,rhod-2以及第三代的Fluo-3,Fluo-4,Fluo-5系列、Calcium Green等.
计算细胞内游离钙离子浓度的公式根据不同荧光剂分两种情况.
第一种是单激发荧光剂（如Fluo-3）
[Ca2+]=Kd[F-Fmin]/[Fmax-F]
其中,Kd为荧光剂与Ca2+形成配合物的解离常数.Fmin是荧光剂没有结合Ca2+时荧光最小值；Fmax是荧光剂被Ca2+饱和时的荧光最大值.
第二种是双激发荧光剂（如fura-2）
[Ca2+]=Kd[R-Rmin]/[Rmax-R]
其中R=F1/F2,F1为激发波长1的荧光强度,F2为激发波长2的荧光强度.Rmin是Ca2+浓度为零时,荧光最小比值,Rmax为饱和浓度的荧光最大比值.
荧光强度测量方法可以用荧光显微镜、共聚焦显微镜和近几年兴起的双光子荧光显微镜.荧光显微镜一般采用氙灯、汞灯等光源；共聚焦显微镜采用激光为激发光源,优点是得到很高的分辨率,记录钙离子三维空间分布；双光子荧光显微镜则采用红外激光作为光源,具有很高空间分辨率,而且背景噪声比较低.
光子显微镜是什么东西？
光子显微镜一种实验方法。
确切说就是建立在激光扫描显微镜技术基础上的实验方法，
它能提供更优秀的光学切片能力。
最大的优点就是对活性标本的杀伤极小，
而且分辨率高。
一般采用飞秒激光器，
能解决生物组织中深层物质的层析成像问题。
能够准确的定位，
因为更准确的定位，
因而保证了更高的三维分辨率，
使背景的干扰相对减少，
进一步提高了图像清晰度。
科研常用的几种显微镜原理及应用介绍
在科研中常见的几种科研型显微镜主要有扫描探针显微镜，扫描隧道显微镜和原子力显微镜几种，下面对这几种显微镜逐一做以介绍：
扫描探针显微镜
扫描探针显微镜
扫描探针显微镜（ScanningProbeMicroscope，SPM）是扫描隧道显微镜及在扫描隧道显微镜的基础上发展起来的各种新型探针显微镜（原子力显微镜AFM,激光力显微镜LFM，磁力显微镜MFM等等）的统称，是国际上近年发展起来的表面分析仪器，是综合运用光电子技术、激光技术、微弱信号检测技术、精密机械设计和加工、自动控制技术、数字信号处理技术、应用光学技术、计算机高速采集和控制及高分辨图形处理技术等现代科技成果的光、机、电一体化的高科技产品。
扫描探针显微镜以其分辨率极高（原子级分辨率）、实时、实空间、原位成像，对样品无特殊要求（不受其导电性、干燥度、形状、硬度、纯度等限制）、可在大气、常温环境甚至是溶液中成像、同时具备纳米操纵及加工功能、系统及配套相对简单、廉价等优点，广泛应用于纳米科技、材料科学、物理、化学和生命科学等领域，并取得许多重要成果。SPM作为新型的显微工具与以往的各种显微镜和分析仪器相比有着其明显的优势：
首先，SPM具有极高的分辨率。它可以轻易的“看到”原子，这是一般显微镜甚至电子显微镜所难以达到的。
其次，SPM得到的是实时的、真实的样品表面的高分辨率图像。而不同于某些分析仪器是通过间接的或计算的方法来推算样品的表面结构。也就是说，SPM是真正看到了原子。
再次，SPM的使用环境宽松。电子显微镜等仪器对工作环境要求比较苛刻，样品必须安放在高真空条件下才能进行测试。而SPM既可以在真空中工作，又可以在大气中、低温、常温、高温，甚至在溶液中使用。
因此SPM适用于各种工作环境下的科学实验。SPM的应用领域是宽广的。无论是物理、化学、生物、医学等基础学科，还是材料、微电子等应用学科都有它的用武之地。SPM的价格相对于电子显微镜等大型仪器来讲是较低的。任何事物都不是十全十美的一样，SPM也有令人遗憾的地方。
由于其工作原理是控制具有一定质量的探针进行扫描成像，因此扫描速度受到限制，测效率较其他显微技术低；由于压电效应在保证定位精度前提下运动范围很小（目前难以突破100μm量级），而机械调节精度又无法与之衔接，故不能做到象电子显微镜的大范围连续变焦，定位和寻找特征结构比较困难；目前扫描探针显微镜中最为广泛使用管状压电扫描器的垂直方向伸缩范围比平面扫描范围一般要小一个数量级，扫描时扫描器随样品表面起伏而伸缩，如果被测样品表面的起伏超出了扫描器的伸缩范围，则会导致系统无法正常甚至损坏探针。
因此，扫描探针显微镜对样品表面的粗糙度有较高的要求；由于系统是通过检测探针对样品进行扫描时的运动轨迹来推知其表面形貌，因此，探针的几何宽度、曲率半径及各向异性都会引起成像的失真（采用探针重建可以部分克服）
扫描隧道显微镜
扫描隧道显微镜
扫描隧道显微镜(scanningtunnelingmicroscope，STM)扫描隧道显微镜的英文缩写是ＳＴＭ。这是２０世纪８０年代初期出现的一种新型表面分析工具。由德国人宾宁(G.Binnig,1947-)和瑞士人罗勒(H.Roher,1933-)1981年发明，根据量子力学原理中的隧道效应而设计。
宾宁和罗勒因此获得1986年诺贝尔奖.1988年，IBM科学家从由扫描隧道显微镜激发的纳米尺度的局部区域观测到了光子发射，从而使发光及荧光等现象能够在纳米尺度上进行研究。1989年，IBM院士（IBMFellow）DonEigler成为第一个能够对单个原子表面进行操作的人，通过用一台“扫描隧道显微镜”操控35个氙原子的位置，拼写出了“I-B-M”3个字母。1991年，IBM科学家演示了一个原子开关。
基本原理：其基本原理是基于量子力学的隧道效应和三维扫描。它是用一个极细的尖针，针尖头部为单个原子去接近样品表面，当针尖和样品表面靠得很近，即小于１纳米时，针尖头部的原子和样品表面原子的电子云发生重叠。此时若在针尖和样品之间加上一个偏压，电子便会穿过针尖和样品之间的势垒而形成纳安级１０Ａ的隧道电流。通过控制针尖与样品表面间距的恒定，并使针尖沿表面进行精确的三维移动，就可将表面形貌和表面电子态等有关表面信息记录下来。扫描隧道显微镜具有很高的空间分辨率，横向可达０．１纳米，纵向可优于０．０１纳米。它主要用来描绘表面三维的原子结构图，在纳米尺度上研究物质的特性，利用扫描隧道显微镜还可以实现对表面的纳米加工，如直接操纵原子或分子，完成对表面的刻蚀、修饰以及直接书写等。目前扫描隧道显微镜取得了一系列新进展，出现了原子力显微镜ＡＦＭ、弹道电子发射显微镜ＢＥＥＭ、光子扫描隧道显微镜ＰＳＴＭ，以及扫描近场光学显微镜ＳＮＯＭ等。
或者用一个金属针尖在在样品表面扫描。当针尖和样品表面距离很近时(1nm以下)，针尖和样品表面之间会产生电压。当针尖沿X和Y方向在样品表面扫描时，就会在针尖和样品表面第一层电子之间产生电子隧道。该显微镜设计的沿Z字形扫描，可保持电流的恒定。因此，针尖的移动是隧道电流的作用，并且可以反映在荧光幕上。连续的扫描可以建立起原子级分辨率的表面像。
特点：与电子显微镜或X线衍射技术研究生物结构相比，扫描隧道显微镜具有以下特点∶
①高分辨率扫描隧道显微镜具有原子级的空间分辨率，其横向空间分辨率为lÅ，纵向分辨率达0.1Å，
②扫描隧道显微镜可直接探测样品的表面结构，可绘出立体三维结构图像。
③扫描隧道显微镜可在真空、常压、空气、甚至溶液中探测物质的结构，它的优点是三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察，而普通电镜只能观察制作好的固体标本，由于没有高能电子束，对表面没有破坏作用(如辐射，热损伤等)所以能对生理状态下生物大分子和活细胞膜表面的结构进行研究，样品不会受到损伤而保持完好。
④扫描隧道显微镜的扫描速度快，获取数据的时间短，成像也快，有可能开展生命过程的动力学研究。
⑤不需任何透镜，体积小，有人称之为"口袋显微镜"(pocketmicroscope)。
原子力显微镜
原子力显微镜
原子力显微镜:是一种利用原子,分子间的相互作用力来观察物体表面微观形貌的新型实验技术.它有一根纳米级的探针,被固定在可灵敏操控的微米级弹性悬臂上.当探针很靠近样品时,其顶端的原子与样品表面原子间的作用力会使悬臂弯曲,偏离原来的位置.根据扫描样品时探针的偏离量或振动频率重建三维图像.就能间接获得样品表面的形貌或原子成分。
它通过检测待测样品表面和一个微型力敏感元件之间的极微弱的原子间相互作用力来研究物质的表面结构及性质。将一对微弱力极端敏感的微悬臂一端固定，另一端的微小针尖接近样品，这时它将与其相互作用，作用力将使得微悬臂发生形变或运动状态发生变化。
扫描样品时，利用传感器检测这些变化，就可获得作用力分布信息，从而以纳米级分辨率获得表面结构信息。它主要由带针尖的微悬臂、微悬臂运动检测装置、监控其运动的反馈回路、使样品进行扫描的压电陶瓷扫描器件、计算机控制的图像采集、显示及处理系统组成。微悬臂运动可用如隧道电流检测等电学方法或光束偏转法、干涉法等光学方法检测，当针尖与样品充分接近相互之间存在短程相互斥力时，检测该斥力可获得表面原子级分辨图像，一般情况下分辨率也在纳米级水平。
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