课程：

• 1、测定蛋白质中二硫键位置的经典方法是什么
• 2、要测定蛋白质的二硫键位置，需用什么方法
• 3、什么是二硫键的定位：（对角线电泳）
• 4、蛋白质链内 二硫键位置的确定
• 5、怎样确定一个蛋白质中二硫键的位置

测定蛋白质中二硫键位置的经典方法是什么

对角线电泳是一种经典的二硫键定位分析方法。这种技术包括：（1）胃蛋白酶酶切未经还原的蛋白质；（2）在酸性pH＝6．5的条件下进行第一向电泳，酶解产物肽段将按其大小及电荷的不同而分离；（3）将滤纸暴露在过甲酸（CHOOOH）蒸气中，使二硫键氧化断裂，并进一步氧　化成磺酸基，被氧化的半胱氨酸称为磺基　丙氨酸；（4）将滤纸旋转90。角，在与第一向完全相同　的条件下进行第二向电泳。无二硫键的肽不受酸的作用而在两向电泳中迁移率相等，将位于一条对角线上。那些含二硫键的肽由于第二向电泳时被酸氧化，肽段大小和负电荷发生变化而使迁移率不同，将偏离对角线。肽斑可通过茚三酮显色来确定。将含　磺基丙氨酸的肽段分别取下，进行氨基酸序列分析，推断二硫键的位置。如果蛋白质中存在其他未成二　硫键的半胱氨酸，要先用碘乙酰胺封闭其一SH后再酶解。此外甲硫氨酸和色氨酸也能被氧化，这样可能会增加分析的复杂性。

要测定蛋白质的二硫键位置，需用什么方法

对角线电泳是一种经典的二硫键定位分析方法.

这种技术包括：

（1）胃蛋白酶酶切未经还原的蛋白质；

（2）在酸性pH＝6．5的条件下进行第一向电泳,酶解产物肽段将按其大小及电荷的不同而分离；

（3）将滤纸暴露在过甲酸（CHOOOH）蒸气中,使二硫键氧化断裂,并进一步氧　化成磺酸基,被氧化的半胱氨酸称为磺基　丙氨酸；

（4）将滤纸旋转90.角,在与第一向完全相同的条件下进行第二向电泳.无二硫键的肽不受酸的作用而在两向电泳中迁移率相等,将位于一条对角线上.那些含二硫键的肽由于第二向电泳时被酸氧化,肽段大小和负电荷发生变化而使迁移率不同,将偏离对角线.肽斑可通过茚三酮显色来确定.将含磺基丙氨酸的肽段分别取下,进行氨基酸序列分析,推断二硫键的位置.如果蛋白质中存在其他未成二硫键的半胱氨酸,要先用碘乙酰胺封闭其一SH后再酶解.此外甲硫氨酸和色氨酸也能被氧化,这样可能会增加分析的复杂性.

什么是二硫键的定位：（对角线电泳）

二硫键定位分析

蛋白理论分子量为M1，有n各半胱氨酸：

1 直接测定蛋白的分子量，得到Mw－2x，然后用DTT将全部二硫键打开得到M1

x即为该蛋白含有的二硫键的个数

2 将蛋白利用4－VP处理得到分子量MW＋105y，y即为该蛋白含有的游离半胱氨酸个数，x＋y＝n

3 将该蛋白利用合适的酶进行酶切（trypsin，chymotrypsin...），联用分析

得到肽谱，计算理论上出现的肽段以及实际得到的肽断.

4 将酶解得到的多肽混合物用DTT将全部二硫键打开，联用分析，与3得到的肽断混合物比对，计算出现的新肽断，则二硫键位于新出现的肽断之间

5 如果一个肽断上有两个cys，则需要先利用4－vp处理蛋白，然后酶解，DTT还原，将目标肽断进行MS3分析，即得到同一肽断上那各cys以二硫键的形式存在

6 如果两个disulfide交叉，则需要利用分部还原，多用TCEP。

7 常用还原二硫键的试剂DTT，TCEP， 常用还原衍生Cys上的巯基的试剂4－vp等。

蛋白质链内 二硫键位置的确定

可以参考《生物化学》王镜岩 上 P179

先要完成全部氨基酸测序。

首先用胃蛋白酶水解已测序的蛋白质，再用Brown-Hartlay对角线电泳，分离出几组含二硫键的肽段。（就是几个偏离对角线的肽斑，用茚三酮检验）

对每一组含二硫键的肽段用测氨基酸序列的方法测得两条以二硫键相连的序列。对照已知的全部氨基酸序列，可知哪里和哪里以二硫键相连。

这是电子版《生物化学》下载地址

怎样确定一个蛋白质中二硫键的位置

二硫键位置的确定

一般用蛋白酶水解带有二硫键的蛋白质，从部分水解产物中分离出含二硫键的肽段，再拆开二硫键，将两个肽段分别测序，再与整个多肽链比较，即可确定二硫键的位置。常用胃蛋白酶，因其专一性低，生成的肽段小，容易分离和鉴定，而且可在酸性条件下作用（pH2），此时二硫键稳定。肽段的分离可用对角线电泳，将混合物点到滤纸的中央，在pH6.5进行第一次电泳，然后用过甲酸蒸汽断裂二硫键，使含二硫键的肽段变成一对含半胱氨磺酸的肽段。将滤纸旋转90度后在相同条件下进行第二次电泳，多数肽段迁移率不变，处于对角线上，而含半胱氨磺酸的肽段因负电荷增加而偏离对角线。用茚三酮显色，分离，测序，与多肽链比较，即可确定二硫键位置。

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还有一种方法，

蛋白质中二硫键的定位及其质谱分析