课程：

• 1、双光子显微镜的概述与原理
• 2、如何利用激光共聚焦显微镜进行胞内蛋白定位
• 3、双光子显微镜的双光子显微镜的优势
• 4、光子显微镜是什么东西？

双光子显微镜的概述与原理

双光子荧光显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术的一种新技术。双光子激发的基本原理是：在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收 2 个长波长的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子；其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。双光子激发需要很高的光子密度，为了不损伤细胞，双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，其脉冲宽度只有 100 飞秒，而其周期可以达到 80 至 100 兆赫。在使用高数值孔径的物镜将脉冲激光的光子聚焦时，物镜的焦点处的光子密度是最高的，双光子激发只发生在物镜的焦点上，所以双光子显微镜不需要共聚焦针孔，提高了荧光检测效率。

如何利用激光共聚焦显微镜进行胞内蛋白定位

要用一个线粒体特异性的探针或者线粒体特异性定位的蛋白做免疫荧光以标记线粒体的位置,再以一种不同颜色的二抗标记目的蛋白,最后观察两种荧光的叠加情况.如果需要更精确的可以分离线粒体后用western blot检测.如果想用形态学方法建议共聚焦或者免疫电镜,选一种吧,但是看过很多线粒体的文章,用共聚焦的更多,不过需要根据的实际情况吧,免疫电镜也是认可的.

Ca2+作为细胞内的第二信使,调控着许多重要的生理活动.从六十年代开始,一些研究小组就已经开始合成各种荧光剂进行定量检测Ca2+浓度,目前常用的荧光剂有第二代的fura-2,indo-1,rhod-2以及第三代的Fluo-3,Fluo-4,Fluo-5系列、Calcium Green等.

计算细胞内游离钙离子浓度的公式根据不同荧光剂分两种情况.

第一种是单激发荧光剂（如Fluo-3）

[Ca2+]=Kd[F-Fmin]/[Fmax-F]

其中,Kd为荧光剂与Ca2+形成配合物的解离常数.Fmin是荧光剂没有结合Ca2+时荧光最小值；Fmax是荧光剂被Ca2+饱和时的荧光最大值.

第二种是双激发荧光剂（如fura-2）

[Ca2+]=Kd[R-Rmin]/[Rmax-R]

其中R=F1/F2,F1为激发波长1的荧光强度,F2为激发波长2的荧光强度.Rmin是Ca2+浓度为零时,荧光最小比值,Rmax为饱和浓度的荧光最大比值.

荧光强度测量方法可以用荧光显微镜、共聚焦显微镜和近几年兴起的双光子荧光显微镜.荧光显微镜一般采用氙灯、汞灯等光源；共聚焦显微镜采用激光为激发光源,优点是得到很高的分辨率,记录钙离子三维空间分布；双光子荧光显微镜则采用红外激光作为光源,具有很高空间分辨率,而且背景噪声比较低.

双光子显微镜的双光子显微镜的优势

双光子荧光显微镜有很多优点：

1）长波长的光比短波长的光受散射影响较小容易穿透标本；

2）焦平面外的荧光分子不被激发使较多的激发光可以到达焦平面，使激发光可以穿透更深的标本；

3）长波长的近红外光比短波长的光对细胞毒性小；

4）使用双光子显微镜观察标本的时候，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。所以，双光子显微镜比单光子显微镜更适合用来观察厚标本、更适合用来观察活细胞、或用来进行定点光漂白实验。

光子显微镜是什么东西？

光子显微镜一种实验方法。

确切说就是建立在激光扫描显微镜技术基础上的实验方法，

它能提供更优秀的光学切片能力。

最大的优点就是对活性标本的杀伤极小，

而且分辨率高。

一般采用飞秒激光器，

能解决生物组织中深层物质的层析成像问题。

能够准确的定位，

因为更准确的定位，

因而保证了更高的三维分辨率，

使背景的干扰相对减少，

进一步提高了图像清晰度。