课程：
亚细胞定位
亚细胞定位是指某种蛋白或表达产物在细胞内的具体存在部位。如仅在核内存在，还是胞质内存在，还是细胞膜上存在。
GFP实际是给你要研究的物质加上标记。使用GFP必须构建融合蛋白载体，并有效表达。这样在荧光显微镜下，如果看到细胞内某一部位存在GFP信号，则说明和GFP融合的蛋白也存在于该部位，这样就达到了确定某物质亚细胞定位的目的。
真核细胞亚细胞定位实验的原理及步骤？
原核细胞（Prokaryotic cells），也就是细菌等生物体的简单细胞，有时被比喻为单间小屋：它们没有内部膜，所以它们就像一个单间，没有墙壁可以分割。如果我们把这个类比扩展到真核细胞，也就是构成植物、真菌和动物的更复杂的细胞，我们会发现，它们在房地产市场上是绝对升值的。
就像一个大的家庭住宅被分割成许多不同用途的房间（卧室、浴室、厨房、起居室等），真核细胞也包含了各种不同的具有专门功能的隔间，彼此之间用膜层整齐地分开。这种组织方式让每个隔室都能保持自己的条件，也就是它开展工作所需要的条件。
例如，被称为溶酶体（lysosomes）的隔室，作为细胞的回收中心，必须保持一个酸性的pH值，以处理细胞废物。同样，被称为过氧化物酶体（peroxisomes）的结构也会进行被称为氧化反应的化学反应，并产生过氧化氢，如果不把它们安全地存放在自己的 "房间 "里，这两种物质都会损害细胞。
在一个细胞内保持不同环境的能力，使得真核细胞可以进行复杂的代谢反应，而原核生物则不能。事实上，这也是为什么真核细胞可以长到比原核细胞大很多倍的重要原因。
原核细胞对比真核细胞
真核细胞的主要特征是什么？与原核细胞不同，真核细胞具有：
一个膜结合的细胞核（nucleu），一个被膜包围的中央空腔，里面有细胞的遗传物质。
一些膜结合的细胞器（organelles），是漂浮在细胞液中的具有特殊功能的细胞室。细胞器的意思是 "小器官"，这个名字反映了细胞器就像我们身体的器官一样，作为一个更大系统的一部分，具有独特的功能。
多条线型染色体（linear chromosomes），而不是原核生物的单条圆形染色体（single circular chromosome）。
真核细胞比原核生物的细胞要复杂得多。它们充满了一系列迷人的亚细胞结构，在能量平衡、新陈代谢和基因表达方面发挥着重要作用。
为了更好研究HD1基因的亚细胞定位，我们构建了含有35s启动子：HD1-GFP的双元载体
这是动物还是植物细胞工程？看起来像植物，双元载体的话，质粒应该比较大，应该不是打基因枪或是原生质体了，一般是用农杆菌侵染烟草表皮瞬时转化吧。有很多protocol，我就提供一份我用过的吧：
1 载体转化入农杆菌；2 工程菌单克隆于YEB培养基 28℃，过夜培养；3. 1%扩大培养于新培养基（YEB+100uM AS+ 10mM Mes【pH5.7】）；4 收集农杆菌，用注射液（10mM MgCl2+10mMMes【pH5.7】）+20uM AS；）将农杆菌稀释至OD600=1左右，室温活化3h；5 用注射器注射烟草成熟叶片； 6 避光2-3天； 7 Confocal 观察
成败关键：1 农杆菌菌株毒力强一点好EHA105，GV3101比较好，LBA404不好；2 AS诱导；3 农杆菌需要一定时间活化； 4 所用烟草要健康，叶片要大而平整，方便注射
烟草亚细胞定位没有信号
烟草亚细胞定位有信号
真核细胞和原核细胞的区别是看是否有以核膜为界的细胞核。 按照以前老教材的解释就是：原核细胞是没有核膜包围的细胞核的。 在真核细胞中细胞核内是有细胞质存在的。在原核细胞中由于没有核膜包围的细胞核，所以细胞质是可以和细胞核相互依存的。预测蛋白质的亚细胞定位，是通过生物信息学的方法的。
或者你在NCBI数据库中比对到了编码类似蛋白的基因，如果该基因有人做过亚细胞定位的实验，你也可以大概知道其编码的蛋白质在细胞内部的定位。
QQ客服
新浪微博